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离心机全血基因组提取DNA的应用

2014/10/13 9:50:59??????点击:

离心机全血基因组提取应用


操作步骤(200ul全血)
# 第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇!

1. 取200ul新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液,放入1.5ml离心管。
对如果全血起始量小于200μl,则用缓冲液BB补足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之间,则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μl-1毫升之间,则需要先进行红细胞裂解操作(见本说明书后附录)。

2. 加入200μl 结合液CB,立即剧烈颠倒轻摇,充分混匀,再加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液,颠倒轻摇充分混匀,70℃放置10分钟,溶液应变清亮(但颜色偏黑色)。

3. 加入100μl 异丙醇,剧烈颠倒轻摇,充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
上述各操作步骤中适当力度充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀,但不可用手剧烈振荡,以免剪切DNA。

4. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)10,000 rpm离心30秒,倒掉收集管中的废液。

5. 加入500μl抑制物去除液IR,12,000 rpm 离心30秒,弃废液。

6. 加入700μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。

7. 加入500μl漂洗液WB,12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。

8. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热), 室温放置3-5分钟,12,000 rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000 rpm离心1分钟。洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于50μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。

10. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。

操作步骤(300ul和 1ml全血)

1. 汲取900μl红细胞裂解液(可向本企业购买)到一个1.5ml离心管或者3ml红细胞裂解液到一个15ml离心管。

2.将抗凝全血(使用前回复到室温)颠倒混匀后,汲取300μl全血和1ml全血分别加到上述1.5ml和15ml离心管中,颠倒6-8次,并倒置轻弹管壁,确保充分混匀。

3.室温放置10分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞)。

4.12,000 rpm离心20秒(对于1.5ml离心管),2,000-3,000 rpm离心5分钟(对于15ml离心管)倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团),留下完整的管底白细胞团和大约10μl的残留上清。离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3,4。
5. 加入200μl缓冲液BB涡旋振荡重悬白细胞团,充分分散白细胞团。其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬,影响后续实验裂解效果,建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本。

6. 现在可以按照操作步骤提取DNA了。

操作步骤(10ml全血)

1.汲取30ml红细胞裂解液到一个50ml离心管。

2.将抗凝全血(使用前回复到室温)颠倒混匀后,汲取10ml加到上述装有红细胞裂解液离心管中,颠倒6-8次,并倒置轻弹管壁,确保充分混匀。

3.室温放置10分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次或者摇床上面轻摇帮助裂解红细胞)。

4.2,000 x g离心10分钟,倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团),留下完整的管底白细胞团和大约100μl的残留上清。离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入适量红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3,4。

5. 涡旋振荡15秒重悬白细胞团,充分分散白细胞团。白细胞的重悬分散对下一步裂解非常重要,白细胞未打散就加入裂解液,会导致白细胞不能充分裂解,形成肉眼可见团块。

6. 加入10ml细胞核裂解液到重悬的白细胞,迅速有力吹打几次混匀 以裂解白细胞,由于基因组DNA立即释放出来,这个时候混合物会马上变得十分粘稠,立即停止吹打(以免剪切断基因组DNA),颠倒旋转离心管10次保证裂解液和所有的白细胞接触并裂解。这一步对是否获得满意的裂解效果和基因组完整性很关键。吹打力量如果太小,不足以迅速将细胞团打散并和裂解液混匀,形成肉眼可见团块无法裂解完全(裂解液如果是和细胞团块而不是分散的细胞接触,立即会和细胞团块表面作用后形成粘稠的屏障,不容易再渗透入团块内部)。裂解液和细胞接触后基因组DNA立即释放出来,这个时候吹打力量过大,又易造成基因组断裂。正确做法,就是迅速有力的吹打几次,几秒钟后基因组释放出来(变粘稠)立即停止吹打,或者改用大口径枪头(剪去枪头尖)轻柔吹打或者颠倒混匀。如果还有肉眼可见团块,可在65℃温育30-60分钟(不要超过一小时)至裂解完全。

7. 可选步骤:在裂解物中加入RNase A(10mg/ml)至终浓度30μg/ml,颠倒25次混匀,37℃温育15分钟去除残留RNA.然后冷却回室温。

8.加入3.33ml蛋白沉淀液后,在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀20-25秒。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。由于样品体积重量小,用涡旋振荡器振荡混匀产生的剪切力并不会剪切打断基因组DNA,如果用手振荡混匀,则不可以用手上下剧烈振荡混匀,只能适当力度振荡混匀,否则会剪断基因组DNA,但是力度也不能小,要保证充分混匀,将粘稠的裂解物打散开,否则DNA无法和蛋白质沉淀分离开, 离心的时候会和蛋白质一起沉淀下来,造成DNA丢失或者降低产量。此外混匀不充分也可能造成蛋白沉淀不充分, 最后的产物污染有较多量的蛋白质。因此建议新手还是用涡旋振荡器混匀。

9.2,000 x g(可根据离心效果(沉淀如果不紧)调整加大离心力)离心10分钟。这时候应该可以见到管底暗褐色的蛋白沉淀,也可能见到一些蛋白沉淀漂浮在液体表面。

10.小心汲取上清(大约10ml)到一个新的15ml离心管中。汲取上清时小心不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀,如果不小心将蛋白沉淀转入新的离心管中,可再次离心2分钟后取上清。

11.加入等体积的室温异丙醇(约10ml),轻柔颠倒30次混匀或者直到出现棉絮状(丝状)白色DNA沉淀。
注意有时候棉絮状(丝状)DNA沉淀颠倒混匀的时候,粘附着在盖子或者管口处,即使颠倒也不跟下来,或者附着有气泡导致漂浮在液面,这样导致操编辑看不到沉淀,误认为没有得到DNA。解决办法是略去步骤12,直接2,000 x g离心1分钟,弃上清,然后接步骤14。

12.垂直放置离心管,让白色DNA沉淀自然沉到管底,然后尽可能多的吸弃大部分的上清,注意不要吸到沉淀。

13.加入10ml70%乙醇后,颠倒混匀,2,000 x g离心1-3分钟,在管底可以见到白色的DNA沉淀块,倒弃上清。

14.加入3ml70%乙醇,颠倒几次漂洗DNA沉淀,2,000 x g离心1分钟, 倒去上清(沉淀很松,注意不要把DNA沉淀倒掉了),倒置后在吸水纸上轻敲几下以控干残留乙醇,还可以用枪头小心吸掉管底沉淀周围和管壁的残留乙醇,空气晾干沉淀几分钟。注意不要干燥过头,否则DNA极其难溶,也不能残留太多乙醇,否则乙醇可能抑制下游如酶切反应。

15.加入600μlDNA(或者根据浓度需要调整用量)溶解液重新水化溶解DNA沉淀,轻弹管壁混匀,可以放置在65℃温育30-60分钟(不要超过一小时),也可以在室温或者4℃放置过夜来重新水化DNA,中间不时的轻弹管壁帮助重新水化DNA。

16. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。

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