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利用大肠杆菌检验离心机的检测方法

2014/1/24 10:29:41??????点击:

  微生物学中细菌的检验往往需要一周时间,其结果对临床和药品生产已无太大意义,尤其在药品半成品检验中更不能适应药品生产的要求。虽有改进方法的报道,但仍脱离不了传统检验方法,且专属性、灵敏度差。现根据抗原抗体特异性结合的原理及实际经验,试用大肠杆菌抗血清检测大肠杆菌抗原获得成功。

1 实验部分

1.1 设备与材料

  健康新西兰大耳白家兔(第一军医大学动物实验中心)。大肠杆菌(44102-15,卫生部药品生物制品检定所);临床分离大肠杆菌菌株(南方医院检验科)UV-265紫外分光光度计;摇床恒温水浴箱、卢湘仪大肠杆菌检验离心机、震荡器、灭菌大试管、毛细管、玻片、注射器管。0.5%石炭酸溶液、硫柳汞溶液、饱和硫酸胺溶液、磷酸盐缓冲液、盐酸溶液、氢氧化钠溶液等。实验用材料均需灭菌处理。

1.2 方法与结果

1.2.1 大肠杆菌抗原的制备 取5 ml石炭酸生理盐水,注入经24 h培养的大肠杆菌斜面,洗下菌苔并移至无菌三角锥瓶中,于60℃摇床恒温水浴箱中放置4 h,取出,摇匀。比浊法、平皿法同时计数,用石炭酸生理盐水稀释至9×109/ml再放入60℃水浴箱中11.5 h,取少许做无菌实验,其余菌悬液放冰箱保存。

1.2.2 大肠杆菌抗血清的制备 取无菌检查合格的菌悬液,按表1所示[1],经兔耳静脉注射,并按表2经兔耳静脉取血清1 ml利用卢湘仪大肠杆菌检验离心机进行分离,用玻片法测定效价,结果第14日效价最高为15120,经兔动脉取第14日血[2]制成最大斜面,冰箱中过夜,收集血清,加硫柳汞液约2.5 ml/30 ml血清。

1 大肠杆菌抗原注射剂量时间表

Table 1 Schedule of injection time and dosage of Antigen of E.C.bacilus

Time Dosage (ml) Avoirdupois of rabbit (kg) 

One day 0.2 1.8 

Two day 0.4 2.0 

Four day 0.6 1.9 

Six day 2.0 2.0 

1.2.3 抗血清保存实验 取大肠杆菌抗血清原液及稀释液置冰箱中,于不同时间测定效价,结果抗血清至少可保存50 d(2)。 

2 保存时间实验

Table 2 Test of time antiserum kept

 

Efficiency of

antiserum Firmly extent 

10 d 20 d 30 d 40 d 50 d 60 d 

15120 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 

12560 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 

11280 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 

1640 +++ +++ +++ +++ ++ ++ 

1320 +++ +++ ++ ++ + - 

+++++表示玻片法、试管法均形成牢固凝胶;+表示玻片法凝胶牢固,试管法不牢固;-表示玻片法、试管法均不凝固

1.2.4 混合抗血清的制备 取大肠杆菌(44105-15)与临床、药物分离菌株制备混合抗原和混合抗血清,结果混合抗血清的效价为14 800

1.3 大肠杆菌原检测

1.3.1 检测已知抗原 取大杨杆菌(44102-15)1株,临床分离菌株5株,药物分离菌株4株及药物污染大肠杆菌(44102-15)后分离菌株5例,用玻片法以1320效价的抗血清检测,结果全部阳性(阳性、阴性对照均成立,阴性用灭活的葡萄球菌,沙门氏菌)

1.3.2 检测未知抗原 将受检药品和临床标本经24 h培养的肉汤增菌液和卢湘仪离心直接分离(10 000 r/min)的样品液分别与混合抗血清进行实验,结果与传统法一致(3)

3 样品测定结果

Table 3 Result of sample checked

 

Sample(share) This method Traditional method 

+ - + - 

SP of cell(12) 1 11 1 11 

LP of sell(6) 0  6 0  

SP of self-product(36) 2 34 2 34 

LP of self-product(25) 3 22 3 22 

Clinic sample(3) 2  1 2  

SP=Solid preparationLPLiquid preparation

2 讨论

2.1 抗原抗体凝集为一特异、灵敏的方法需要制备多种抗原族的抗体才能满足不同抗原的要求,用混合抗体检测不同抗原族的大肠杆菌基本可满足日常工作需要,达到快速、准确。对于单抗原细菌,则只需制备相应抗原的抗体即可。

2.2 混合抗体的制备需要适当选择抗原族,以免制成的混合抗体不能检出规定的细菌而造成漏检。

2.3 文中方法制备抗原须灭活细菌,抗体制备须研究抗原的注射剂量、注射时间和取血时间,避免抗原制备失败或抗体效价不理想。且所需细菌样品要求不严格,用离心沉降集菌法或增菌培养均不影响检验的灵敏度和准确性。

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