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肝细胞离心机两步原位灌流法分离肝细胞

2014/3/11 10:28:26??????点击:

目的:离体培养肝细胞是一种可以精确模仿体内肝脏活动的简单系统,广泛应用于肝病机理、药物代谢、生物人工肝系统、生物化学致癌研究等。
背景常识:肝细胞的原代培养的成功与否,主要与肝细胞的分离培养相关。肝细胞的分离方法分为机械法和酶消化法,机械法分离的肝细胞数目很少难以满足试验的要求。酶消化法包括胰酶消化和胶原酶消化,胰酶消化法条件难以控制因此没有的到广泛的推广,胶原酶消化法早在20世纪60年代初就得到了应用,1976年Seglen在前人的基础上形成了两步原位灌流法,这是目前国际上流行的肝细胞分离方法,它具有分离效果好,细胞产率高,存活率高,对细胞损伤小,细胞维持肝细胞特异性功能时间长等特点。

原理:无

主体内容:
参照文献及本人的试验经验总结操作步骤如下
器材:剪刀、镊子、止血钳、头皮针、20ML
20ml注射器,缝合线、大头针、75%乙醇、肝脏灌洗液(DHanks)、0.02%胶原酶V(加与胶原酶等质量的Cacl2)
步骤:1、将小鼠拉颈处死,用大头针固定于手术台。
2、75%乙醇对腹部进行消毒,打开腹腔,用大头针将腹部的皮肤固定于身体两侧,充分暴露腹腔。
3、找到门静脉,将头皮针插入门静脉,用手术线固定头皮针。汲取10ml肝脏灌流液从门静脉注入肝脏,可观察到肝脏变白膨胀,剪断下腔静脉时肝脏冲洗后的液体从下腔静脉流出。
4、肝脏冲洗干净后,注入5ml胶原酶V,室温原位消化肝脏10分钟。
5、将肝组织剪成小块至于5ml 0.02%的胶原酶V中,37度消化30分钟。
6、用胶头滴管反复吹打挤压肝组织使肝细胞分离脱落。
7、将细胞悬液吸至灭菌的玻璃离心管内,加5ml DMEM完全培养液终止消化,800rpm离心5分钟,可见白色的肝细胞沉淀。
8、汲取上清,滴一滴于载玻片上,镜下观察可见全是组织碎片而无肝细胞。
9、将上清弃掉,加加5ml DMEM完全培养液悬浮肝细胞,800rpm离心5分钟。如此反复清洗肝细胞去除组织碎片。
10、将纯化后的肝细胞加入10ml DMEM全培养液,至于10cm板37度培养。

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