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离心机分离生物T淋巴细胞的技术

2011/12/28 11:32:09??????点击:

(一)原理 混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时,B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上,而多数T细胞则通过尼龙毛柱,是获得富含T细胞群的有效方法。

(二)材料及试剂

1.尼龙毛(Femwall Laboratories,LP-1 Leukoqak leukocyte Filters)。
2.烧杯、铝箔、漏斗、一次性手套等。
3.装填尼龙毛柱,一次性注射器。
4.取自然沉降的上层血浆,过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后,获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层。

(三)操作方法

1.尼龙毛的清洗与干燥

(1)戴上已经洗去滑石粉的一次性手套,将尼龙毛(1包或2包,每包35g)放入烧杯中,加入蒸馏水或去离子水,用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min。
(2)冷却至常温,倒入漏斗内,使水滴干。
(3)重复(1)、(2)步骤6次。
(4)将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内,37℃温箱干燥2~3天后,贮藏在带盖的方盘内。

2.装尼龙毛柱

(1)取50ml玻璃注射器,拔去注射芯,在注射器头上套一段带夹子的胶管。
(2)将尼龙毛梳理,并适当折叠,以适应注射器的直径,填入注射器内,约20ml的体积。
(3)将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好,高压灭菌。

3.细胞分离

(1)将注射器固定在支架上,倒入37℃的细胞培养液,关闭阀门一定时间,然后打开阀门,放掉细胞培养液,以清洗几次尼龙毛,关上阀门。
(2)将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度,约5.00×107个细胞/ml。
(3)将细胞液倒入注射器内,使之没过尼龙毛柱。盖上注射器,37℃温育45min 至1h。
(4)打开下口,缓慢放流(1滴/min),收集于离心管中。 (5)离心,即获所需的T淋巴细胞。
(6)关闭注射器下口,于注射器内加入0.85%冰冷生理盐水,振荡,并套上注射器芯,打开下口,使劲推出注射器内液体,即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等。

(四)注意事项

1.此种分离法,T淋巴细胞也常有一部分被吸附,吸附的多少与尼龙毛的质量有关,与装柱的松紧也有关系。
2.此法的T淋巴细胞的回收率约20%~30%。
3.用过的尼龙毛可回收,以盐水洗涤,然后浸入0.1Mol/L的HCl中过夜,然后再同前法清洗。 单核细胞分离技术

(一)铁粉吸附法

1.材料及试剂

(1)铁粉或羰基铁粉(Atomergic chemetals)99%的纯度,颗粒小于60µm(Goodfellow Metals)。
(2)强磁铁(马蹄形)。
(3)一块小棒状磁铁(约1cm长)。
(4)毛细吸管等。

2.操作方法

(1)称取一定量的铁粉,一般为10g,用100ml生理盐水洗涤4次,去除任何可溶性有毒物质。在倒去盐水时,用强磁铁吸住铁粉。
(2)用50ml生理盐水混悬铁粉。摇匀后,分装于10个瓶中,包扎瓶口,121℃灭菌20min,拿出后马上轻轻摇匀,防止铁粉结块,储藏备用。
(3)临用前,倒去瓶中的生理盐水,加入适量的单个核细胞悬液(3ml~5ml,细胞总数为8×107个/瓶)。37℃温育45min,中间不时晃动,使铁粉悬浮起来。
(4)加入一块小磁铁棒于瓶中,让其吸住铁粉以及附着在铁粉上的细胞。
(5)倒出悬液,此悬液主要是淋巴细胞,离心,收集。
(6)在铁粉瓶内倒入一定量的Hank’s液,用力振摇后,以强磁铁吸附,几分钟后,倒出液体。
(7)2 000r/min离心液体,管底即为单核细胞。

(二)玻璃板吸附法 将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内,置37℃ 30 min~40min,用毛细吸管轻轻汲取悬液,即为淋巴细胞。用适量的Hank’s液冲洗平皿,收获即为单核细胞悬液。

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