hjc888老品牌黄金城

搜索???Search
联系大家???Contact
你的位置:hjc888老品牌黄金城 >

低速离心机分离红细胞的技术

2011/12/28 10:22:04??????点击:

材料与试剂

1.肝素等抗凝剂 2.3%明胶液 取明胶3g,溶于0.9%灭菌盐水100ml中,114.3℃灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存。临用时,37℃预热10min。 3.阿氏液

(二)操作方法

1.采血抗凝,即为红细胞。由于红细胞与白细胞的比例相差悬殊,一般白细胞混杂在其中,忽略不计。
 
2.根据红细胞的用途,可做进一步的处理。如计算红细胞,可直接稀释计。如需做补体结合反应,或其它溶红细胞反应,则需将红细胞进行充分的清洗,以除去附着在红细胞膜表面的血浆。一般用等渗的稀释液连续清洗,2 000r/min离心10min,重复3~4次。

3.如需储藏备用,则以阿氏液做抗凝剂采血,混匀后置4℃冰箱保存,可保存2周,其活性尚可。

淋巴细胞的分离技术

(一)材料与试剂

1.淋巴细胞分层液有两种:

(1)聚蔗糖—泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成40±1%(W/V)水溶液,也有干粉出售。应用时,用蒸馏水配制9%溶液。泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名Vrografin,结构式为3,5—二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇。含量为60%或75%,每安瓶为20ml装,常用于人的脏器造影。应用时,取60%泛影葡胺原液20ml,加双蒸馏水15.38ml,即为33.9%泛影葡胺。 1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制: 9%聚蔗糖液     24份 33.9%泛影葡胺液  10份 混合即可。必要时,可测比重。需要备用,可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min,4℃保存。一般可保存3月。 如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算: 式中dm为分层液的比重,d1和d2分别为9%聚蔗糖和33.9%泛影葡胺的比重,V1和V2分别为它们的体积。如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液,则9%的聚蔗糖和33.9%的泛影葡胺的比例应为100︰46.3。

(2)泛影葡胺—右旋糖酐(dextran)液 34%泛影葡胺液  10份 60%右旋糖酐液  12.5份 混合,即为比重1.07~1.09的分层液。分装于棕色瓶中,4℃冰箱保存备用。 2. 3%的明胶液 称取明胶3g,溶于0.9%的灭菌生理盐水,终体积100ml,114.3℃高压灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存,临用时37℃预热10min。 3.Hank’s液。

(二)操作方法

1.取抗凝血,自然沉降,如是马属动物的血液,可直接直立试管架上,让其自然沉降1h,取上层血浆。如是牛、羊血液,由于其血沉速度非常慢,可加等量3%明胶液,混匀后让其自然沉降,1h后取上层血浆。
 
2.2 000r/min离心10min,弃上清。
 
3.沉淀用Hank’s液混悬后,再2 000r/min离心10min。
 
4.重复步骤3一次,再用细胞营养液将白细胞制成悬液。此液含有整个白细胞群,包括粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和部分红细胞。可供白细胞计数用。

5.取2ml细胞分层液于离心管内,同时用毛细吸管汲取约2ml的血浆(自然沉降1h的上层血浆)轻轻加入分层液上,直接加抗凝血也可。
 
6.以水平转子离心机2 000r/min离心20min。离心后,可见分成多层,最下层是红细胞,中间层是分层液,最上层是血浆。在血浆层与分层液之间是一薄层较致密的白色层,即为单个核细胞层。
 
7.用毛细吸管插入到单个核细胞层并汲取该层,放入另一试管中。

8.以Hank’s液洗涤、离心,最后配制成适当的白细胞浓度。必要时可计数。

(三)注意事项

1.血浆或血液加入分层液中时要小心,缓慢不要打乱液层、不要摇动。也可以将分层液加入到血浆的上层。
 
2.保持淋巴细胞的活性是非常重要的,所以一般情况下,是现采血,马上进行分离。
 
3.经过分层液分离的淋巴细胞层,实际上是单个核细胞层,包括单核细胞,不包括粒细胞。欲分离出纯的淋巴细胞,则按下法除去单核细胞,或收获单核细胞。

48.3K
XML 地图 | Sitemap 地图