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低速大容量离心机分离免疫细胞技术

2014/3/21 11:12:49??????点击:

一、免疫细胞分离技术


1、淋巴细胞的分离
取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀释后,沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1 淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合,然后2000r/min 水平离心20min,管内分为4 层,自上而下依次为血浆,单个核细胞,颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上),沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks 液洗两次,每次2000r/min 离心10min,最后用RPMI l640 培养液将细胞配成2×106/m1 的细胞悬液备用。


2、T 细胞及B 细胞的分离
将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱,B 细胞粘附于尼龙棉上,T细胞则不粘附,先用RPMI l640 培基洗脱尼龙棉柱,流下的细胞悬液含有丰富的T 细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B 细胞,并用少量的RPMI l640 培基洗脱,此细胞悬液含有丰富的B 细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少,视分离细胞的多少而定。


3、CD4 细胞及CD8 细胞的分离
(1)CD4 细胞的分离:将一定量的T 细胞悬液通过一根SephDdexC—10 柱,然后用少量的RPMll640 培养洗涤,收获的细胞悬液约含85%的CD4 细胞。
(2)CD8 细胞分离:用Tris 缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg/m1)包被一平皿表面,然后放置4℃过夜,没有包被上的抗体用PBS 洗净。然后将已标记有抗CD8 单克隆抗体的T 细胞(细胞浓度为1×l07/m1)3m1 加入上述的平皿内,4℃放置2 小时,用PBS 轻轻洗净末粘附的细胞,然后用毛细管加入10m1 PBS 吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640 培基中备用。CD4 细胞亦可用此法分离。


4、单核巨噬细胞的分离
单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性,而淋巴细胞则无此特性,借此可将这两类细胞分开,其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内,置于37℃ C02 温箱内温育1 小时,然后用RPMI 1640 培基轻轻漂洗平皿表面,去除非粘附细胞,再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷,收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞,可重复上述过程。

 

二、肿瘤细胞株的传代培养
传代细胞是指来自人或动物的肿瘤组织或正常组织的细胞,其染色体组型发展为非整倍体或二倍体低于75%,这种非整倍体细胞在体外具有无限传代的生命力,通常具有异种移植的能力和较广泛的病毒敏感性。传代细胞的特性是:①具恒定繁殖特性,少数细胞即有繁殖能力,在琼脂内能形成克隆;有的为贴壁生长,有的悬浮生长。②染色体组型为异倍体,大多数人源细胞染色体为60-70 条左右。③保留种属特异性,但组织分化性与脏器特性均消失。④具致癌性。由于传代细胞繁殖迅速,易获取、易保存,已为各实验室广泛采用。

1、HeLa 细胞的传代培养
试剂与仪器
●HeLa 细胞。
●Hanks 液,0.25%胰蛋白酶,0.02%EDTA,生长液,青、链霉素(PS),5.6%NaHCO3
●小三角烧瓶,培养瓶,无菌吸液管(5m1 及1m1)、毛滴管,废液瓶等。
方法与步骤
(1)选生长良好的HeLa 细胞一瓶,轻轻摇动培养瓶数次,悬浮起浮着在细胞表面的碎片,然后连同生长液一起倒出,用Hanks 液洗一次。
(2)从无细胞面侧加入0.25%胰蛋白酶液或胰蛋白酶一EDTA 消化液4-5ml,翻转培养瓶,使消化液浸没细胞1min 左右。
(3)翻转培养瓶,放置5—10min,为促进细胞的消化,可以加入37℃预热的消化液,或在细胞面向上时,用手掌贴着细胞面的瓶外壁,待肉眼观察细胞面出现布纹孔状为止。
(4)倒出消化液,如系EDTA 消化,需沿细胞层的对面加Hanks 液4.5m1 洗涤,洗涤时轻轻转动培养瓶,让液体在瓶内慢慢流动,以洗掉消化液;如系胰蛋白酶消化,倒掉胰酶后可不洗涤。
(5)沿细胞面加入适量新配制的生长液,洗下细胞,并用吸管吹打数次,使细胞分散开,按1:2 或1:3 分配传代培养。
(6)37℃培养,接种后30min 左右可贴壁,48 小时可换生长液,一般3—4 天可形成单层,形成单层后再换维持液供试验用。

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